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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷酸性反应呈现组学、LC-MS/MS磷酸性反应位点阐述技术服务。
英文版版头：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文翻译题头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
潜在客户政府部门：山东大学
探讨资料：拟南芥侧根
拜谱提供了技术设备：磷过酸表达组学、LC-MS/MS磷过酸位点深入分析
研究分析工作思路：
PART 01 钻研的结果
01、种植素催进VIK的磷过酸还有其转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用蛋白质多组分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 的生长素有利于VIK的磷硝化作用下列关于转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化试验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过鲜酵母双有性杂交分享（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶相互依存成相实验性（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷酸性反应实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。时实降钙素原检测PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素警报更好地控制 LR 生长发育
完成讲解多个VIK T-DNA加入基因组组变异体（vik-2和vik-3），发掘与天然的型相对比，基因组组变异体的LR强度、LR原基（LRP）和已成长发展的LR有明显以减少，通常是vik-2（图2）。反过来，过传达VIK的转基因水稻组水稻组茎叶成绩出LR强度增大。还有就是，在vik-2基因组组变异体蓝本下传达VIK的转基因水稻组水稻组茎叶可以恢复了LR成长发展弊病。出现素处置试验表面，vik-2基因组组变异体对出现素诱导型的LR成长发展发生反应减少，表面VIK在出现素房产调控LR成长发展中利用根本反应。 
图2 VIK介导的健康发育素卫星信号信号通路朝国家宏观调控LR的健康发育
03、VIK 与ERF13 去热学人机交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子荧光同质 （BiFC）和免疫性共放置实验设计（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13上下级反应
04、VIK以正负极馈的方试调节作用ERF13磷酸性反应
通过磷碱化蛋白酶组学阐述，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点转变发现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈形式磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷硝化作用增进ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过休外工作和身体内工作，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟系统和磷酸解离突变的体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚体细胞导航定位深入分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸加快速度了ERF13分解
06、VIK 介导的 ERF13 磷酸性反应控制 LR 的经常出现
设计进每一步刍议了VIK调节管控的ERF13生物光降解在侧根（LR）發育中的帮助。在特别有差异 转染色体常绿绿植系的LR表型，发掘过呈现方法ERF13阻止了LR的会会展现，在vik变化体中那样阻止帮助增进，而在过呈现方法YFP-VIK的图片背景下那样阻止帮助削弱（图6）。不仅而且，特别ERF13的有差异 磷酸性反应模仿和磷酸解离变种体的过呈现方法常绿绿植系，发掘ERF132A-Myc（磷酸解离）的常绿绿植系LR会会展现减少，而ERF132D-Myc（磷酸性反应模仿）的常绿绿植系LR会会展现略多。以上但是说明，VIK介导的ERF13磷酸性反应和生物光降解增强了LR的会会展现。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸有利于促进LR的会出现
07、VIK在侧根健康中磷过酸并固定LBD18蛋白酶
用进行分析俩个VIK T-DNA插入表格甲基化性率的体（vik-2和vik-3），感觉与野外型相对来说，甲基化性率的体的侧根（LR）孔隙率、LR原基（LRP）和已阴茎健康成长期的LR不错削减，越发是vik-2（图7）。反过来，过表述爱VIK的转基因食品组水稻遗传茎叶症状出LR孔隙率增高。还有就是，在vik-2甲基化性率的体的背景下表述爱VIK的转基因食品组水稻遗传茎叶回到了LR阴茎健康成长期瑕疵。种子发芽素进行处理工作呈现，vik-2甲基化性率的体对种子发芽素促进的LR阴茎健康成长期生理反应减小，呈现VIK在种子发芽素干预LR阴茎健康成长期中起着的关键使用。 
图7 VIK 在LR建成步骤中真接磷碱化和相对稳定LBD18蛋清
PART 02 一篇文章个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷碱化蛋清质组学定量分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的生长期素无线信号改善侧根演变成
PART 03 拜谱个人心得体会
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核苷酸质组学、淡化核苷酸质组学、细胞代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—过高进一步DIA·磷碱化修饰语组，采用创新聚集能力+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现绿植模本10w+、绿植模本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参看文献资料：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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